GB/T 41309-2022 英文版 纳米技术 纳米材料的内毒素体外测试 鲎试剂法

　　提供更多标准英文版信息。

　　1范围

　　本文件描述了应用鲎试剂法(LAL)评价体外生物系统应用的纳米材料的内毒素水平。该测试方法适用于检测分散在水、血清或反应液等水性溶液中的纳米材料,这些介质可与纳米材料在37C孵育-定时间。

　　本文件适用于体外样品的检测，同时这些方法也适用于通过非胃肠道途径应用到动物体内的纳米材料。

　　2规范性引用文件

　　本文件没有规范性引用文件。

　　3术语 和定义

　　下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1

　　凝固蛋白原coagulogen

　　LAL试剂中可凝固的蛋白,在内毒素引起的凝胶形成中发挥首要作用。

　　注;来源于日本微( Tachypleus tridentatus)凝固置白原含有175个氨基酸.分子量为19 723(见参考文献[7])。

　　3.2

　　凝固蛋白coagulin

　　凝固蛋白原被LAL试剂中的凝固蛋白酶酶解后的产物。

　　注:来源于日本猛( Tachypleus tridenatus)凝固蛋白含有N末端片段(丙氨酸1-精氨酸18)和c末端片段(甘氨酸

　　47-辈丙氨酸175)(见参考文献[7])。

　　3.3

　　内毒素endotoxin

　　革兰氏阴性菌细胞壁外部成分的一部分。

　　注:主要的活性成分是脂多糖(LPS)。

　　3.4

　　内毒素单位

　　endotoxin unit

　　EU

　　内毒素活性的标准单位。

　　注1:根据世界卫生组织( WHO)生物标准化专家委员会(ECB11996年制定的内毒素单位定义,0.1 ng大肠杆菌

　　0113; HKI0;K(- )来源的WHO内毒索参考标准品(RSE)的活性为10 EU/ng (见参考文献[8])。

　　注2: EU等同于内毒索的团际单位(IU)。

　　4縮胳语

　　下列缩略语适用于本文件。

　　BET:细菌内毒素检测(bacterial endotoxin test)

　　CSE:对照标准内毒索(control standard endotoxin)

　　ECBS:生物标准化专家委员会(expert committee on biological standardization)

　　EF:无内毒素(endotoxin-fre)

　　EU:内毒素单位( endotoxin unit)

　　1/EC:抑制/增强对照(inbibition/ enhancement control)

　　LAL:鲎试剂(Limulus amebocyte lysate) .

　　LPS:脂多糖( Lipopolysaccharide)

　　OD;光密度(optical density)

　　RSE:内毒素参考标准品(reference standard endotoxin)

　　WHO:世界卫生组织( World Health Organization)

　　5测试前考虑 因素

　　5.1纳米材 料的储存

　　由于纳米材料的表面积大，能吸附包括内毒素在内的多种污染物。因此，纳米材料在使用前应收集并储存在无内毒素.可封闭的容器(例如玻璃器具)中。应使用合适的阴性对照,例如无内毒素的金属氧化物粉末.如二氧化钛.二氧化硅等,来验证无内毒素污染。

　　注1.由于存在可能对LAL测试产生干扰的因素(见附录A),宜避免使用聚内烯-类材质的的塑料制品儒存纳米材料。

　　注2:无内毒素的金属氧化物纳米材料能通过热处理获得(见5.2)。

　　5.2储存容器

　　6测试样品

　　6.1水分 散液

　　水中可分散的纳米材料可以直接进行LAL测试,也可利用无内毒索水稀释后检测。

　　6.2水浸 提液

　　纳米材料经无内毒素的反应介质.生理盐水或者其他没提介质浸提后.可作为LAL测试的样品。

　　7测试样品的准备

　　7.1分散方法

　　测试分散液可以用下面一种或几种方法制备:

　　手动研磨:

　　机械研磨;

　　超声分散。

　　分散介质由特定体外检测的目标和特点决定。

　　注:纳米材料具有大表面积、多孔性.疏水性和其他导致分散闲难的特性.因此需要发展新的方法。

　　7.2浸提方法

　　浸提的条件,例如浸提液.孵育浸提时间、浸提温度和测试样浓度可模拟相关体外测试的浸提条件。

　　为避免颜色的干扰.优选没有pH指示剂(酚红)的反应介质或缓冲盐水作为没提介质。浸提介质宜确认无内毒素或由无内毒素试剂配制。在浸提介质中添加抗生素和抗真菌药物可以有效防止细菌和真菌的生长。宜验证所添加的抗菌物质对LAL试剂的干扰(见8.3.3)。浸提后.没提复合物需要离心去除颗粒物;作为LAL测试的测试样品的上清液需要利用无内毒素枪头收集到无内毒素的管或容器中。

　　包括离心条件在内的浸提条件应确认并做记录,其中离心条件需要根据所要研究的纳米材料来确定。

　　注1:宜用0.05%聚山梨醇酯20作为玻璃纤維过滤器中气相内毒索的浸提液(见参考文献[9])。

　　注2: 0.1%的维生素E表面活性剂(维生素E聚乙婦醇1000现珀酸酯)可以改善碳纳米物体内毒素的浸提效果(见乡考文献[10])。

　　注3:更多视提的方法信息，见ISO 10993-12007.

　　7.3浓度

　　如果有必要,测试样品应以细胞体外测试中的最高浓度分散在无内毒素水中。

　　7.4测试样 品的储存

　　8.1 原理

　　内毒素活化LAL试剂中的一个因子,引起蛋白級联酶解反应(见参考文献[12])。凝固酶原被活化因子活化后,释放凝固酶.进而催化凝固蛋白原产生凝固蛋白。凝固蛋白自发地通过二硫键结合,使LAL浑浊,最终形成凝胶。凝胶的形成原则上通过倒置试管后肉眼检查决定。这种方法不需要光学检测仪,且易操作。现有最灵敏的商业化凝胶监试剂的最低检测限为0.015EU/mL。

　　注:凝胶方法的实际操作步骤见附录B.

　　8.2可选择的测试方法

　　8.2.1终点显色方法

　　在特定的反应时间后,测量反应混合物的光密度(OD)。终点显色法有两种技术:-种是通过浊度测量检测反应混合物的混浊度，一种是利用显色技术检测从合成基质释放的对确基苯胺(p-NA),例如凝固酶敏感的叔丁氧碳基亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-LeuGly-Argp-NA)或叔丁氧羰基-苏氨酸-甘氨酸-精氨酸对硝基苯胺(BoeThr-Gly-Arg-p-NA)。由于灵敏度低和在指定的时间点无法停止混浊的产生,动态比浊法已经取代了简单的比浊法(见7.2.2)。测量反应混合物中的p-NA至少有两种方法

　　9结果评估

　　9.1 总则

　　在评估纳米材料的LAL测试结果时.宜进行科学的判断.考虑测试的局限性。特别是要考忠到纳米材料可能会对LAL测试带来的干扰。在这种情况下,应讨论干扰效应的可接受限度,并对数据进行仔细解读。

　　9.2关于测试应用的指导

　　9.2.1如果通过稀释测试样品或采取其他措施无法成功克服干扰，则LAL测试不能应用于此类测试样品。

　　9.2.2当内毒 素污染不可避免时,能用多粘菌素B等试剂处理,以去除内毒素的影响(见参考文献[15-16])。

　　9.2.3除了 内毒索之外,普通的LAL.试剂还与β-1,3-葡聚糖反应(见参考文献[12])。血清可能被来源于醉母、真菌或其他微生物的B-1,3-葡聚糖污染。因此，需要特别注意,宜使用不含3-1.3-葡聚糖的血

　　清来制备测试样品。当怀疑存在β-1,3葡聚糖污染时,宜使用不与β 1,3-葡聚糖反应的特异性LAL试剂检测。

　　10测试报告

　　10.1测试报告应与测试步骤相符。